酵母“造”水稻“种”猪“生产”:人血清蛋白

  在细菌中受挫后,人血清白蛋白基因被人带到了酵母体内碰碰运气,几乎获得成功。

  1983年,世界上第一例转基因植物——含有抗生素药类抗体的烟草——在美国成功培植,1994年,世界上第一种转基因作物——转基因晚熟西红柿(现已退出市场)——正式投放美国市场。2016年,全球已有26个国家批准种植转基因作物,全球转基因作物种植面积达1.851亿公顷,创历史新高,全球种植总面积累计达21亿公顷,相当于美国国土面积的2倍。

  据《南方都市报》报道,2016年底中科院广州生物医药与健康研究院利用基因编辑技术,将猪血清白蛋白基因替换成人血清白蛋白基因,已获得纯合子基因编辑猪,重组人血清白蛋白在猪血中含量可达20克/升,下一步将主要需要攻克重组蛋白纯度等难关。

  1981年,美国一家著名生物科技公司首次克隆人血清白蛋白的cDNA序列,并将其插入到一种大肠杆菌体内,大肠杆菌会将人血清白蛋白基因整合到自己的基因组,分泌出重组人血清白蛋白。经验证,这种重组蛋白与人血液中的天然蛋白氨基酸序列完全一致。不过该重组蛋白不能形成正确的空间结构,蛋白聚集难以溶解,因而不具备正常功能。

  由于动物与人存在更近的进化关系,二者的大多数基因具有较高的同源性,动物细胞也能像人类细胞一样,合成出空间结构和生理功能与天然蛋白完全一致的重组蛋白。

  由于人血清白蛋白主要在血液中分泌,于是有人设想如果利用动物的血液系统,是否能更高效地生产重组人血清白蛋白。2013年中国农业大学科研人员用人血清白蛋白cDNA序列对猪血清白蛋白基因序列进行了替换,培育出血清白蛋白基因人源化的转基因猪。由于采用的是人血清白蛋白cDNA序列,且只替换猪血清白蛋白一个等位基因,属于杂合子,因此转基因猪血液中重组人血清白蛋白表达量偏低,仅有0.2克/升,目前该课题组正在进行纯合子转基因猪培育,预计重组人血清白蛋白表达量将有所提高。

  人血清白蛋白还可以储存起来,挽救一些休克、大出血、手术性失血等重症病人的生命,其临床用量非常之大,仅我国每年需求量就达420吨。不过,人血清白蛋白总是非常短缺,我国人血清白蛋白产量仅能满足1/4的市场。科学家们只能想方设法通过基因工程的方法大规模生产人血清白蛋白。在这个过程中,

  之后,研究人员攻克了重组蛋白纯化难关,将重组蛋白纯度提高到99.9999%,彻底解决了注射用重组蛋白杂质过敏问题。2017年5月16日,植物源重组人血清白蛋白注射液获得临床批件,成为世界上第一个进入临床试验的植物源重组人血清白蛋白产品。

  1992年,以色列科学家首次将人血清白蛋白基因和绵羊β-乳球蛋白启动子组成新的基因,将其转入小鼠受精卵获得转基因小鼠,转基因小鼠可以将这个来自人类的基因一代代遗传下去,并在绵羊β-乳球蛋白启动子的引导下,转基因母鼠在其乳汁中生产出重组人血清白蛋白,这种生产方式被称为动物乳腺生物反应器,后来山羊和兔乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物都被批准上市,是继微生物发酵、哺乳动物细胞培养体系之后,第三代基因工程制药技术。

  由于重组人血清白蛋白临床上每个剂量高达10-40克,而且每克售价只有3-5美元,因此人血清白蛋白基因需要继续旅行,努力找寻成本更低、效率更高的重组蛋白生产方式。

  酵母是人类利用了数千年的一类单细胞微生物,在酿制美酒、制作面包等方面应用广泛。上世纪七十年代末,随着基因工程技术兴起,酵母被发现是高效合成外源蛋白的理想工具,不仅具有细菌生长快、遗传操作简单的特点,也能像高等生物一样合成空间结构正确的蛋白质。

  人血清白蛋白基因位于人的第4号染色体上,约有2.2万个碱基对,但负责编码蛋白氨基酸序列只是其中9%的基因序列,也就是该基因的cDNA序列。

  令人惊奇的是,人血清白蛋白会形成一种心形的立体结构(详见文章配图),呈心形的血清白蛋白分子进入血液后就无法停止脚步了,随着血液在全身循环旅行约1.5万圈后才被逐步从机体清除出去,这一过程大概需要20天。与此同时,新的蛋白分子被肝细胞合成并补充进血液中。

  随着基因技术的兴起,人血清白蛋白基因也被赋予特殊使命,踏上了神奇之旅,去找寻更有效、更便捷、更低廉的蛋白合成工厂,以解决人血清白蛋白短缺难题,挽救更多人的生命。

  后来又有人将人血清白蛋白cDNA序列引入到一种叫枯草芽孢杆菌的微生物体内,虽然表达出可溶性的重组蛋白,但是其空间结构还是不正确。人血清白蛋白基因只能寻找其它出路了。

  2009年,美国GTC生物制药公司研发人员将山羊β-酪蛋白启动子与人血清白蛋白基因全序列结合,组成新的基因,并将新基因转入到奶牛细胞中,通过体细胞克隆技术,培育出转有新基因的转基因奶牛。与转基因小鼠一样,这些转基因母牛产奶后,其乳汁中就能检测到重组人血清白蛋白,每升牛奶中含有1-2克重组蛋白,其中有一头转基因母牛重组蛋白高达48克/升。值得一提的是,该公司正是开发出国际上第一个动物乳腺生物反应器重组蛋白医药产品的公司。

  作为高等真核生物,转基因植物很早就被用来开展农业新品种培育和重组蛋白表达研究。其优势就是不需要大量昂贵的培养基,只需要足够阳光,就能利用光合作用生产出大量的重组蛋白。

  正常情况下,血清白蛋白含量偏低时,人体会产生一种信号,并将这种信号传递到血清白蛋白的合成器官——肝脏。肝细胞得到合成指令后,会严格按照人血清白蛋白基因提供的“图纸”,生产出足够的人血清白蛋白,并送到血液中。

  实验室培育的人血清白蛋白转基因水稻植株很快被移植到数百亩的稻田中,如普通稻田一样,在工作人员的精心照顾下,转基因水稻茁壮成长,几个月后就结出的丰硕稻谷。由于采用了水稻种子特异元件,它可指导人血清白蛋白基因只在稻谷中合成,在根、茎、叶等水稻其它组织中检测不到重组蛋白。就这样,一个人血清白蛋白基因,转入水稻中,沐浴着阳光,在稻米中生产出大量的重组人血清白蛋白,无疑是一种节能、环保、高效、低成本的重组蛋白生产方式。

  1999年,日本科学家培育出了高效合成重组人血清白蛋白的基因工程毕氏酵母,重组蛋白在每升培养液中含量可达10克以上,其分子结构、理化性质和生理功能均与天然蛋白一致。经过一系列临床试验,2007年作为治疗肝硬化的药物获得日本政府批准,2008年在日本正式上市,成为第一个重组人血清白蛋白药物。但好景不长,由于免疫毒性问题和生产数据造假等原因,2010年该产品又被日本药监局撤回而退市。

  经过不懈努力,中国武汉大学教授杨代常和同事克服了这些问题,培育出高效生产重组人血清白蛋白的转基因水稻,有望开创新的大规模重组人血清白蛋白生产体系。研究人员为了人血清白蛋白更适合在水稻种子中合成,对人血清白蛋白基因进行了改造和优化,同时将其与水稻种子特异启动子组成新的基因,利用农杆菌将新基因转入水稻基因组中,获得转基因水稻植株(图2)。

  对于人体来说,人血清白蛋白(human serumalbumin)不可或缺。它是人血浆中最丰富的一种蛋白质,在正常人血浆中的含量超过血浆蛋白质总量的50%,主要负责维持血管内外压力平衡和血浆容量,并能结合和运输一些代谢产物。血浆中血清白蛋白水平偏低往往是某些疾病的信号。

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  人血清白蛋白基因进入的第一种植物是烟草,不过在转基因烟叶中,重组人血清白蛋白仅占烟叶可溶性蛋白总量的0.02%。之后又在马铃薯等植物中获得表达,但是受限于表达效率偏低、重组蛋白结构不正确等问题,效果并不理想。

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